Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
HPLC, czyli wysokosprawna chromatografia cieczowa, to technika analityczna i preparatywna stosowana do oczyszczania, badania czystości oraz identyfikacji związków chemicznych. Jest to forma chromatografii cieczowej kolumnowej, w której próbka jest rozpuszczana w odpowiednim rozpuszczalniku i kierowana na kolumnę wypełnioną złożem porowatym lub żelowym. Kluczowym elementem jest eluent, który powoduje rozdział składników próbki na podstawie ich oddziaływań z fazą stacjonarną i fazą ruchomą.
W HPLC stosuje się wysokie ciśnienie, co różni tę technikę od tradycyjnej chromatografii cieczowej. Wysokie ciśnienie wynika z budowy pomp oraz uziarnienia wypełnienia kolumn. Dzięki tym właściwościom HPLC osiąga wysoką sprawność i rozdzielczość, co pozwala na szybszy rozdział mieszanin na poszczególne związki.
Mechanizmy retencji
W HPLC wyróżniamy dwa główne typy układów faz:
- Normalny układ faz (NP) – faza stacjonarna jest bardziej polarna niż faza ruchoma.
- Odwrócony układ faz (RP) – faza stacjonarna jest mniej polarna niż faza ruchoma, co jest obecnie najczęściej stosowane.
W przypadku RP, substancje są wymywane w kolejności ich hydrofobowości, a układy te charakteryzują się lepszą selektywnością i niższymi kosztami fazy ruchomej.
Aparatura chromatograficzna
Aparaty HPLC składają się z:
- Zbiornika na eluenty i bufory.
- Od gazowacza usuwającego gazy rozpuszczone w eluentach.
- Zaworów proporcjonujących do mieszania fazy ruchomej.
- Pomp zapewniających odpowiedni przepływ eluentu.
- Nastrzykiwacza (iniektora) do wprowadzania próbek.
- Filtrów, prekolumny oraz kolumny z odpowiednim wypełnieniem.
- Termostatu kolumn oraz detektora (np. spektrofotometr UV-VIS).
Analiza próbki w typowym aparacie HPLC trwa od kilku do kilkudziesięciu minut, a zużycie eluentu wynosi zazwyczaj kilka do kilkudziesięciu mililitrów.
Rodzaje chromatografii
W chromatografii cieczowej wyróżniamy różne warianty, w tym:
- NanoHPLC do analiz bardzo małych ilości związków chemicznych.
- Preparatywną HPLC do rozdzielania większych objętości substancji.
- Chromatografię SEC (gel permeation chromatography) do oznaczania mas cząsteczkowych polimerów.
Coraz częściej stosuje się także ultrasprawną chromatografię cieczową (UHPLC), która wykorzystuje krótsze kolumny z mniejszym uziarnieniem, co pozwala na zwiększenie efektywności analizy oraz zmniejszenie zużycia fazy ruchomej.
Podsumowanie
HPLC jest zaawansowaną techniką chromatograficzną, która umożliwia skuteczne rozdzielanie i analizę związków chemicznych, a dzięki ciągłemu rozwojowi technologii, takich jak UHPLC, staje się coraz bardziej efektywna i oszczędna.
