Metoda Sangera
Metoda Sangera, znana również jako metoda dideoksy, jest jedną z kluczowych technik sekwencjonowania DNA. Opracowana przez Fredericka Sangera, który otrzymał za nią Nagrodę Nobla w 1980 roku, polega na kopiowaniu DNA w warunkach in vitro przy użyciu polimerazy DNA.
Etapy reakcji
Proces sekwencjonowania DNA można podzielić na pięć głównych etapów:
- Preparatywny PCR – uzyskanie homogennego DNA.
- Denaturacja – uzyskanie jednoniciowej matrycy.
- Synteza nowych nici z użyciem dNTP i ddNTP oraz startera.
- Elektroforeza na żelu poliakrylamidowym.
- Analiza prążków.
Sekwencjonowanie odbywa się w czterech wariantach, z których każdy wykorzystuje inną dideoksynukleotydową końcówkę (A, C, G, T). Cząsteczki DNA produkowane w tych reakcjach mają różne długości, ale zawsze zaczynają się od tego samego startera.
Mechanizm syntezy
Podczas syntezy DNA, proces przerwania syntezy jest losowy. Gdy polimeraza DNA dołącza do łańcucha dideoksynukleotyd, synteza zostaje zatrzymana. Przykładowo, jeśli matryca DNA zawiera sekwencję GATTCGA, mogą powstać różne długości produktów, w tym:
- [starter]CTA
- [starter]CTAA
- [starter]CTAAGCT
Ostatecznie, wszystkie cząsteczki są rozdzielane w elektroforezie, co pozwala na ich analizę w postaci prążków na żelu.
Analiza wyników
Po przeprowadzeniu elektroforezy, produkty sekwencjonowania są wizualizowane, co tradycyjnie odbywało się poprzez znakowanie radioaktywne. Obserwując układ prążków, można odczytać sekwencję DNA, zaczynając od startera, co pozwala na uzyskanie komplementarnej sekwencji.
Przygotowanie do sekwencjonowania
Aby odczytać dłuższe sekwencje DNA, ważne jest wcześniejsze poznanie fragmentu, co umożliwia przygotowanie odpowiedniego startera. Często wykorzystuje się wektory klonujące, które pozwalają na wbudowanie nieznanego DNA do znanej sekwencji.
Modyfikacje metody Sangera
Metoda Sangera doczekała się wielu modyfikacji, w tym:
- Sekwencjonowanie cykliczne
- Znakowanie fluorescencyjne
Te innowacje przyczyniają się do zwiększenia wydajności i precyzji w sekwencjonowaniu DNA.
